去DNA型细菌RNA提取试剂盒

去DNA型细菌RNA提取试剂盒

easyEXT细菌RNA快速提取试剂盒

目录号：hyy02308 50次

5. 适用范围：

适用于快速提取细菌总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反转录PCR，荧光定量PCR.。

5. 试剂盒组成、储存、稳定性：

试剂盒组成	保存	50次
TE (PH8.0)	室温	6 ml
溶菌酶	4℃	20 mg
裂解液RLT Plus	室温	25 ml
去蛋白液RW1	室温	40 ml
漂洗液RW	室温	10ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇
70%乙醇	室温	9ml RNase-free H2O 第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O	室温	10 ml
基因组DNA清除柱 和收集管	室温	50套
RNase-free 吸附柱RA和收集管	室温	50套

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

 

储存事项：

1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

5. 产品介绍：

本公司推出easyEXT无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H₂0将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。 

 

5. 产品特点：

1. 完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
3. 独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

 

4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达2.0～2.2，基本无DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

 

5. 注意事项

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 所样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3. 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 关于DNA 的微量残留：

一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本公司的easyEXT Plus系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

4. 1. 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
   2. 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
   3. 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。
   4. 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书（公司DNA酶柱上消化试剂盒）。
5. RNA 纯度及浓度检测：

完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细菌中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。 细菌rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于26S 和13S rRNA。细菌RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在2.1-2.2 之间（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2）。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

 

5. 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
• 提取细菌RNA需先配制加了溶菌酶或者lysostaphin的TE(10 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA)，TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/ml。

1. 离心收集1-2ml菌液(10⁸-10⁹细胞)到一个1.5 ml离心管, 尽可能去除上清，注意残留的上清不能超过20μl/每使用100μl TE(见下面步骤2)。
2. 根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在100μl(5x10⁸细胞)/ 200μl(5x10⁸-7.5x10⁸细胞) TE中(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA)，TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/ml，或者直接用TE重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。
3. 室温(15-25℃)温育5分钟/溶菌酶, 或者37℃温育15分钟/ lysostaphin，破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。

注意各种细菌破壁的难易程度不一样，一般革兰氏阴性菌E.coli使用上面的条件就足够了，,甚至可能省略该步骤，但是某些革兰氏阳性菌如B. subtilis难破壁需要提高溶菌酶浓度到15mg/ml和温育时间到10分钟。如果金黄色葡萄球菌需要加入lysostaphin到1mg/ml，37℃温育15分钟。总之不同细菌类型破壁难易程度不同，有的难破壁的种类需要根据用户自己的具体情况调节酶的种类、工作浓度和温育温度、时间，此外还可以联合使用玻璃珠击打，机械破壁，蛋白酶K消化等方法帮助破壁。

4. 短暂离心收集细胞到管底，吸弃上清。涡旋振荡重悬分散细胞。
5. 加入500μl裂解液RLT Plus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13，000rpm离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。

6. 立刻将裂解物加入一个DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）13,000 rpm离心30秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

7. 用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为500μl，滤过时候损失体积应该减去），加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
8. 立刻将混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。
9. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，13，000rpm 离心30秒，弃掉废液。    
10. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。
11. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water， 室温放置1分钟，13,000 rpm 离心1分钟。
13. 如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase free water重复步骤10，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。裂解液RLT Plus。最大处理量不超过10⁷个细胞。