GST标记蛋白质微量纯化试剂盒

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒产品简介：

重组蛋白N 端的GST 谷胱甘肽S 转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用 GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化 GST 标记蛋白质的重要方法。

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒产品规格：

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒运输及保存:

低温运输。收到货后按照以上说明存放各组分，有效期12个月。

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒使用方法：

注意：

1.    每步得到的样品最好都留存少量作为 SDS-PAGE 分析的对照，在下面描述中就不再提醒。

2.    本实验需要用到的 1×PBS 缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供10×PBS 缓冲液而得。PBS 缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌，注意防止污染。

3.    GST 洗脱液的配制方法是将约 80mg GST 洗脱液成分二干粉全部加入到 GST 洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得 GST 洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管。

一:重组蛋白的表达和细菌收集

1.    37℃振荡培养 20 mL含表达质粒的细菌到 OD600=0.6-0.8。

2.    加 IPTG 到终浓度为 0.1 mM，30℃振荡培养 3 小时或 22℃振荡培养 8 小时（或过夜）。

3.    4℃ 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL表达菌液，弃上清。

4.    用 1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g 离心 10 分钟，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。

二：细胞裂解

5.    如果用本产品 A 型，用 1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（1 mL 1× PBS 缓冲液+50 uL溶液 A+ 25 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液）重悬细菌沉淀，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选 1K-10K 频率处理 15 次，每次 20 秒，间隔 1 分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。

6.    如果用本产品 B 型，在 1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（在 20 mL 1×PBS 缓冲液中加入所有 30 mg 溶菌酶干粉，溶解后分装成 1 mL/管，取一管使用，剩余的-20℃放置）中加入 25 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 1 uLBenzonase，用此混合液重悬细菌沉淀后冰上放置 30 分钟，得到细菌裂解物。

7.    将超声或酶法细胞裂解物在13000 g 4℃离心10 分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性 GST 标记蛋白。

三：层析柱的制备和 GST 蛋白纯化

8.    摇晃将谷胱甘肽-Agarose 介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据 GST 蛋白产量决定，100 mL 菌液一般使用 200 uL介质即可）。下列步骤各溶液的用量均针对 200 uL介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。

9.    用 5 mL 预冷的 1×PBS 缓冲液洗柱。

10. 第 7 步得到的上清液（含可溶性 GST 标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 电泳。GST 和谷胱甘肽之间的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在 0.2-1 mL/分钟即可。如要提高 GST 标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合 30 分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。

11.  用 0.5-2 mL 1×PBS 缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）。

12.  用 0.2-1 mL GST 洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含 GST 标记蛋白）。由于可能含蛋白酶污染，所以穿透液不能在 4℃放置，需立即用于后续处理（如浓度测定或 SDS-PAGE 电泳）或-80℃长期放置。

13.  对收集的 2 种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或 SDS-PAGE 分析。注意：如果不预先脱盐，则只能用 Bradford 法或 OD 检测法（1 OD280 约等于 0.5 mg/mL 蛋白）测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于 GST 的分子量为 26 KD，所以在 SDS-PAGE 胶上，GST 标记蛋白将比天然蛋白大 26 KD。

附：GST 柱的恢复（本试剂盒不含所需试剂）

1.    用 3 倍体积的 6 M 盐酸胍处理柱子 10 分钟。

2.    用 3 倍体积的超纯水处理柱子 10 分钟。

3.    用 3 倍体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处理柱子 10 分钟。

4.    用 3 倍体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处理柱子 10 分钟。

5.    再重复 3-4 步两次。

6.    用 3 倍体积的超纯水处理柱子 3 次。

7.    用 3 倍体积的 1×PBS 缓冲液处理柱子 2 次。

8. 堵上漏口，加 3 倍体积的 1×PBS 缓冲液待用。若长时间不用，则第 7 步和第 8 步的 1×PBS 改成 20%的乙醇。