长片段PCR扩增试剂盒

           长片段PCR扩增试剂盒

                          Long taqPCRmix kit

v 适用范围：

一般用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、DNA平未端加A等，产物可直接用于TA克隆。

v 产品组成、储存、浓度：

储存：－20 ℃ 保存。浓度： 5U/µl

v 产品介绍：

一般PCR法具有一定的局限性，特别是难以扩增5 kbp以上的长链DNA，这严重限制了PCR法的推广和应用。通过改变PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer、PCR扩增条件等，使长链DNA的扩增成为可能，这就是LA（Long and Accurate）PCR技术。本试剂盒所用的LA Taq 是Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶，这种混合酶可以染色体和其它细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应。在人的染色体上可以扩增长度可达27 kb的DNA片段，而以λDNA为模板则可以扩增出高达40 kb的片段。

v 举例说明：

按下列组份配制50 μl PCR反应液

v 建议循环条件：

*扩增大片段尤其是20kb以上的片段我们建议15-30循环时每个循环的延伸时间要增加10-15秒“自动延长”时间，如果PCR仪器没有“自动延长”功能，那么设定延伸时间时候建议在原有基础上面增加1-4分钟

v 注意事项：

⒈ 10×LA Taq Buffer pH值较高，可能会形成[Mg(OH)2]沉淀，使用前要充分溶解，并Votex保证可能的沉淀重新溶解，或者37°C温育5分钟，然后Votex充分混匀。

⒉ 扩增长片段强烈推荐使用0.2μl薄壁管。其他试管未经测试。较厚的试管在92℃时不能有效地使模板变性。变性时，尽可能缩短变性时间，降低变性温度。第一步变性在92~94℃下进行2分钟（GC含量高可延长时间达5分钟）。在循环过程中尽可能缩短变性时间（92~94℃下进行10-15秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌呤和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度和时间。变性需要的时间在不同的PCR仪器上稍有不同。

⒊ 如果扩增模板GC含量高或者扩增片段比较长，可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%-8%，最常用2％（<30kb）或者4％（>30kb）往往会改善扩增效果。

⒋ 扩增长片段，引物一般终浓度为0.3-1μM，长度最好为27-36bp；退火温度一般在65℃-70℃，此时退火温度和延伸温度基本一致，可将退火延伸在同一个温度进行，使用2阶段扩增法。当然如果设计的引物在20bp左右，则还是使用传统3阶段扩增法为好。

⒌ 模板一般使用0.01-2.5ng（λphage）或者0.1-1μg(Human)

⒍ 1×LA Taq Buffer中镁离子浓度为2.5mM，建议dNTP浓度为400mM，然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。如果含有较高EDTA或者螯合剂，则应该提高Mg2+；如果要增加dNTP浓度，相应也要增加Mg2+浓度。

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