长片段PCR扩增试剂盒

                          Long taqPCRmix kit

编号

名称

品牌

规格

当日秒杀价

 

0428-100

   Long taqPCRmix kit

Waryong

0.5ml

150.00

 

0428-500

   Long taqPCRmix kit

Waryong

5ml

690.00

 

适用范围

一般用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、DNA平未端加A等,产物可直接用于TA克隆。

产品组成、储存、浓度:

组成

PC2001

PC2002

LA Taq DNA 

Polymerase

250U

3000U

10×LA Taq Buffer

2.5mM Mg2+ Plus

1ml

6×1ml

dNTP(10mM each)

200μl

2.4ml

PCR灭菌水

5ml

75ml

储存:-20  保存。浓度: 5U/µl

产品介绍:

一般PCR法具有一定的局限性,特别是难以扩增5 kbp以上的长链DNA,这严重限制了PCR法的推广和应用。通过改变PCRDNA聚合酶、PCRBufferPCR扩增条件等,使长链DNA的扩增成为可能,这就是LALong and AccuratePCR技术。本试剂盒所用的LA Taq Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶,这种混合酶可以染色体和其它细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应。在人的染色体上可以扩增长度可达27 kbDNA片段,而以λDNA为模板则可以扩增出高达40 kb的片段。

举例说明

按下列组份配制50 μl PCR反应液

LA Taq5 U/μl

0.5 -1μl

10×LA PCR Buffer

Mg2+ Plus    

μl

dNTP Mix(10mM each)

2 μl

模板DNA 2.5ng(λphage或者0.5μg(Human)

噬菌体(0.1-5ng,人基因组(0.1-1μ

?μl

引物 120 μM

0.5-1μl

引物 220 μM

0.5-1μl

灭菌纯水

up to 50μ

建议循环条件:

步骤

温度

时间

循环数目

预变性

94°C

1-2分钟

1

变性

94°C

10-20

10

退火

65°C(视引物而定)

30

延伸

68°C

45-60/kb*

变性

94°C

10-20

15-20

退火

65°C(视引物而定)

30

延伸

68°C

45-60/kb+1-20
“自动延长”/循环*

最后延伸

68°C

10分钟

1

 

*扩增大片段尤其是20kb以上的片段我们建议15-30循环时每个循环的延伸时间要增加10-15秒“自动延长”时间,如果PCR仪器没有“自动延长”功能,那么设定延伸时间时候建议在原有基础上面增加1-4分钟

PCR片段长度
kb

延伸时间
(分钟)

自动延长/循环
(秒)

3

2

1

6

4

2

10

7

5

15

10

5

20

14

10

25

17

10

30

20

15

35

24

15

40

27

20

45

30

20

 

注意事项

⒈ 10×LA Taq Buffer pH值较高,可能会形成[Mg(OH)2]沉淀,使用前要充分溶解,并Votex保证可能的沉淀重新溶解,或者37°C温育5分钟,然后Votex充分混匀。

⒉ 扩增长片段强烈推荐使用0.2μl薄壁管。其他试管未经测试。较厚的试管在92℃时不能有效地使模板变性。变性时,尽可能缩短变性时间,降低变性温度。第一步变性在92~94℃下进行2分钟(GC含量高可延长时间达5分钟)。在循环过程中尽可能缩短变性时间(92~94℃下进行10-15秒),除非模板中富含GC,则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌呤和链断裂,对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时,应该尽可能的降低变性温度和时间。变性需要的时间在不同的PCR仪器上稍有不同。

⒊ 如果扩增模板GC含量高或者扩增片段比较长,可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%-8%,最常用2%(<30kb)或者4%(>30kb)往往会改善扩增效果。

⒋ 扩增长片段,引物一般终浓度为0.3-1μM,长度最好为27-36bp;退火温度一般在65-70℃,此时退火温度和延伸温度基本一致,可将退火延伸在同一个温度进行,使用2阶段扩增法。当然如果设计的引物在20bp左右,则还是使用传统3阶段扩增法为好。

⒌ 模板一般使用0.01-2.5ng(λphage)或者0.1-1μg(Human)

⒍ LA Taq Buffer中镁离子浓度为2.5mM,建议dNTP浓度为400mM,然而要得到最佳结果,优化Mg2+的浓度是必需的。如果含有较高EDTA或者螯合剂,则应该提高Mg2+;如果要增加dNTP浓度,相应也要增加Mg2+浓度。

 

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