高保真PCR扩增试剂盒

                               高保真PCRmix kit

编号

名称

品牌

规格

当日秒杀价

 

0418-100

高保真PCRmix kit

Waryong

100次

240.00

 

0518-500

高保真PCRmix kit

Waryong

500次

790.00

 

产品组成、储存:

组成                        100次       500次

Pfu(5 U/μl)                50μl       250μl

10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus)   1 ml        3ml

dNTP(10mM each)             100μl      0.5 ml

PCR 灭菌水                    5 ml        25 ml

储存:-20 ℃ 

产品介绍:

本试剂盒提供DNA高保真扩增所需要的基本试剂。DNA扩增时,用户需要自行准备模板和扩增所需要的引物。高温嗜热Pfu DNA聚合酶主要用于对保真度要求非常高的DNA扩增,这些扩增要求扩增的产物中不能出现突变等错误。Taq DNA聚合酶的扩增性能很强,但是用Taq扩增的PCR产物中有难以避免的随机突变。Pfu DNA聚合酶除了5′-3′的聚合特性外,还有3′-5′端外切酶活性具有校正DNA扩增过程中突变。Pfu DNA的长片段扩增的能力不及Taq DNA聚合酶,客户如果用于长链PCR扩增,可选用本公司的Long Taq或者Taq Plus DNA 聚合酶。

 

 

 

举例说明:

按下列组份配制PCR反应液

Pfu5 U/μl

0.5 μl

10×Pfu PCR BufferMg2+ Plus    

5 μl

dNTP Mixture10 mM each

1 μl

模板DNA(质粒5-20ng,基因组100-500 ng 

?ul

引物 120 μM

1 μl

引物 220 μM

1 μl

灭菌蒸馏水

up to 50 μl 

 

混匀后,按下表的条件立即进行PCR

循环次数

反应阶段

温度

时间

1

变性

92-94°C

分钟

20-35

变性

退火

延伸

92-94°C

55°C

72°C

30

45

2分钟/kb

1

延伸

72°C

7分钟

 

注意事项:

1. Pfu扩增效率通常比Taq酶差,这是由于Pfu具有3-5的外切酶活性(高保真性)所引起的,不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。Pfu扩增1.5kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。

2. 10×Pfu PCR Buffer中已含有Mg2+,用该缓冲能保证扩增产物的保真性。提高反应体系的pHMg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率,但产物的保真性将有所下降。

3. Pfu扩增时,引物的纯度要求较高,长度要求大于18bpTm55-80之间。引物的浓度在0.1-0.5μM之间,比Taq略高。Pfu具有3-5的外切酶活性可能会降解引物,特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以,Pfu必须是最后加入到反应体系中,并立即进行PCR反应。

4. Pfu的热稳定性比Taq酶高,对于GC含量很高的模板,变性温度可以提高到98,而不会影响Pfu的活性。

5. PCR产物为平端,不能直接用T/A克隆方式克隆。需要加A后才能进行克隆。

 

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