DB3.1感受态细胞

 

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DB3.1感受态细胞100ul*20waryongGX0131-100询价
DB3.1感受态细胞100ul*10waryongGX0131-100s 

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储存条件:-70 ℃ 保存,避免反复冻融
 产品介绍华越洋生产的大肠杆菌DB3.1细胞含有gyrA462基因,对λ嗜菌体的ccdB基因产物的毒性具有抵抗作用,特别适用于转化和扩增包含ccdB基因的质粒载体。使用pUC19 质粒检测,转化效率可达107 cfu/μg DNA.,-70 ℃ 保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用,降低了实验的成本。质量稳定,使用方便,质优价廉。

DB3.13菌株的基因型为:F- gyrA462 endA1 Δ(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) supE44ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(SmR) xyl-5 λ- leu mtl1
 抗生素耐药性:DB3.13感受态细胞具有链霉素抗性。
 操作步骤(以下操作均按无菌条件的标准进行):提示DB3.1 感受态细胞应保存在-70℃ ,不可多次冻融和放置时间过长,以避免降低感受态细胞的转化效率。进行转化操作时,应根据相应温度及无菌条件的要求进行。为防止转化实验不成功,可以保留部分连接反应液,以重新转化,将损失降到最低。
(1)取DB3.1感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中,置于冰浴中。一次转化DB3.1感受态细胞的建议用量为 50-100μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl DB3.1感受态细胞为例。
(2) 向DB3.1感受态细胞悬液中加入目的 DNA ( 100μl 的感受态细胞能够被1ng 超螺旋质粒DNA 所饱和),轻轻旋转离心管以混匀内容物,在冰浴中静置30 分钟。
(3) 将离心管置于 42 ℃ 水浴中放置 90 秒,然后快速将管转移到冰浴中,使DB3.1细胞冷却 2 分钟,该过程不要摇动离心管。此步骤也可将离心管置于室温进行,时间不需十分准确,夏季或室温较高时,可放置5-8 分钟左右;如果室温较低,可延长时间至8-15 分钟左右。条件允许建议使用 42 ℃ 热激方法。
(4)向每个离心管中加入500μl无菌的SOC 或LB 培养基(不含抗生素),混匀后置于37 ℃ 150rpm,摇床振荡培养45 分钟,目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。
(5)无菌条件下,取适量菌液加到含相应抗生素的LB 固体培养基平板上,用无菌的细菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。等平板中的液体完全吸收后,倒置平板,37℃培养12-16 小时。 涂布用量可根据具体实验来调整。转化质粒在10ng 左右,90mm 平皿涂布100μl,55mm 平皿涂布50μl;连接产物的转化菌液建议离心后倒掉大部分上清,余200μl,取100μl 用于涂布。
(6)保留剩余的菌液于 4℃冰箱中,视平板上菌落生长情况决定去留。

DB3.1感受态细胞相关试剂及培养基的制备方法
(1)LB 液体培养基:称取10 g,Tryptone,5 g Yeast Extract 和10 g NaCl 置于1 L 烧杯中。加入约800 ml 的去离子水,完全溶解后用2mol/L 的NaOH 溶液调节pH 值至7.0。加去离子水定容至1 L。分装后,121℃高压灭菌20 分钟。
(2)SOB 和SOC 培养基:称取20g Tryptone ,5g Yeast Extract ,0.5g NaCl 置于1L 烧杯中加入约800ml 的去离子水,完全溶解后再补加10ml 250 mM KCl 溶液,滴加5M NaOH(约0.2ml)调pH 值7.0。 加入去
离子水将培养基定容至1L。121 灭菌20min。使用时加入5ml 灭菌的2M MgCl2 溶液(此种培养基称为
SOB)。再补加经0.22um 过滤除菌的1M 葡萄糖溶液2ml(此种培养基为SOC)。
(3) 转化复苏细菌用的液体 LB 培养基或SOC 培养基:可以一次高压50ml 液体培养基,无菌状态按1ml 每管分装于高压灭菌的1.5ml 离心管中,装于自封袋中,冻存于-20℃中,每次用一支。可以极大地避免培养
基污染和减少劳动量。
(4) LB 固体选择培养基:100ml LB 液体培养基中加入1.5 g 琼脂粉,摇匀后,121℃高压灭菌20 分钟。冷却至50℃左右时加入相应浓度的抗生素(如AMP 浓度通常为100ug/ml),混匀后倒在细菌用的无菌培养皿中,等琼脂凝固后即可使用。
(5)IPTG:称量1.9g IPTG(MW=238.31)充分溶解于40 ml 灭菌水,浓度为200mmol/L。用无菌0.22 μm过滤膜过滤除菌。小份分装后,-20℃保存。
(6) X-gal:用DMF(二甲基甲酰胺)配制成20 mg/ml,小份分装(1 ml/份)后,-20℃避光保存。


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